Créé(e) 01/04/2015 Mis à jour 10/02/2017

Après le succès de nombreux projets de génomique, les laboratoires de recherche sont confrontés à d’innombrables protéines de fonctions inconnues. L'enjeu est donc d’aller au-delà des analyses bioinformatiques afin de valider expérimentalement la fonction de ces protéines.

 L’objectif de ce service est de surmonter le problème de l’expression soluble de protéines provenant d’organismes marins. Pour cela, nous avons utilisé une stratégie à moyen débit adaptée à des organismes marins qui a été validé par un projet pilote financé par le réseau d’excellence ‘Marine Genomics Europe’ intitulé ‘Marine-express’ project (2006-2008) (Groisillier et al, 2010).

Contrairement à une approche classique de l’expression des protéines au cas par cas utilisé généralement par les laboratoires, nous avons mis en place une stratégie originale qui est l’approche en parallèle. Cette approche  repose sur la manipulation des gènes en microplaques 96 puits et sur un protocole unique prédéfinis pour tous les gènes étudiés. Voici un bref aperçu des étapes exécutées par le service pour fournir un produit soluble fiable :

 

  • Analyse bioinformatique des gènes cibles et sélection des amorces spécifiques
  • Préparation des plasmides recombinants
  • Amplification par PCR à partir d'ADNc ou d’ADN génomique fournis par les équipes partenaires
  • Sous-clonage des produits de PCR purifiés dans différents vecteurs d'expression (His-tag ou GST-tag)
  • Sélection des sous-clones positifs par PCR screening

 

  • Transformation de l'ADN recombinant dans les cellules d’E. coli compétentes
  • Optimisation de la surexpression par l’utilisation d’un milieu auto-induit ZYP5052 (Studier, 2005)
  • Préparation des extraits protéiques bactériens (parties solubles et insolubles)
  • Vérification de la présence de protéines recombinantes par électrophorèse SDS-PAGE (12%)
  • Confirmation par purification des parties solubles sur mini-colonnes Microspin His ou GST tag (GE Healthcare Life Science)