Créé(e) 08/11/2019 Mis à jour 18/11/2019
25 nov
2019
09h00
Station Biologique de Roscoff - Salle de conférence
Caractérisation des conductances cationiques des globules rouges humains et de leur implication physiologique et physiopathologique
Doctorant(e)

DAVID MONEDERO ALONSO

Directeur de thèse

Stéphane Egée

Composition du jury:

Dr. Hélène GUIZOUARN, Rapportrice, Université de Nice

Pr. Mariano OSTUNI, Rapporteur,  Université de Paris

Pr. Paola BIANCHI, Examinatrice, Hôpital polyclinique de Milan, Italie  
 
Pr. Lars KAESTNER, Examinateur, Université de Saarland, Allemagne  

Pr. François LALLIER, Examinateur, Sorbonne Université   
 
Dr. Stéphane EGEE, Directeur de thèse, Sorbonne Université 
     

Résumé

Les érythrocytes possèdent de nombreuses voies de transport membranaire. La perméabilité aux anions est très élevée permettant aux chlorures d'être à l'équilibre. Ainsi le potentiel de membrane est proche de cet équilibre permettant aux anions de se déplacer librement. En revanche, la perméabilité aux cations est très faible, mais non nulle. En effet l'existence de voies de fuite couplée au fonctionnement de la pompe 3 Na+/2K+ assure l'équilibre des cations nécessaire à l'homéostasie cellulaire. La membrane des globules rouges est dotée de plusieurs canaux ioniques. Normalement silencieux, ils peuvent dissiper rapidement les gradients ioniques une fois activés. Bien que le canal Gárdos, un canal potassique activé par le Ca2+ et plus récemment le canal Piezo1, un canal mécanosensible, perméable au Na+, au K+, au Ca2+ et au Mg2+, aient été abondamment décrits, la nature exacte de la fuite de cation n'est pas encore complètement élucidée. De nombreuses observations dans des globules rouges matures sains et dans des conditions physiopathologiques conduisent à la conclusion qu'une telle fuite de cations passe par un ou des canal (ux) cationique(s) non sélectif(s) (NSC).

L'objectif principal de la thèse a été d'apporter des éléments de compréhension sur la nature et le rôle des voies de conductances cationiques en conditions physiologiques ou physiopathologiques.

La caractérisation fonctionnelle des voies de conductance cationique est rendue difficile du fait de la prédominance de la conductance anionique qui les masque. Bien que le patch-clamp reste la technique par excellence pour l'analyse de l'activité des canaux ioniques, elle reste néanmoins difficile et laborieuse à utiliser sur des populations des globules rouges hétérogènes. Au contraire, le suivi en temps réel du potentiel membranaire d'une population cellulaire facilité par le CCCP, un ionophore à proton, permet d'observer directement l'activité des canaux ioniques lorsque leur ouverture modifie le potentiel membranaire.

Lors de cette étude, l'utilisation du NS3623 à des concentrations supérieures à celles requises pour l'inhibition des voies de conductances anioniques montre que ce composé active les canaux cationiques non sélectifs permettant ainsi leur étude y compris en conditions hyperpolarisantes.

Les propriétés de ce composé ont ensuite été utilisées pour décrire fonctionnellement les altérations de l'homéostasie cationique dans certains cas d'anémie héréditaire à l'aide de cellules de patients affectés par différentes mutations sur les canaux Gárdos ou Piezo1. Cette technique est rapide, fiable et peu coûteuse, elle pourrait constituer un outil de diagnostic alternatif avec l'avantage supplémentaire de donner des informations sur l'activité des canaux ioniques in situ, corrélées à la sévérité qui peut varier pour des patients porteurs de la même mutation.

Enfin, la dernière partie de la thèse porte sur l'altération de l'équilibre des cations dans des conditions de stockage à des fins de transfusion. Pour répondre à cette question, l'activité des canaux ioniques a été caractérisée tout au long de la période de stockage réglementaire des globules rouges stockés à 4° C (42 jours). En utilisant les protocoles dédiés et mis au point lors de l'étude des patients porteurs de mutations héréditaires j'ai pu montrer que l'activité du/des NSC augmentait avec le temps, devenant spectaculaire la dernière semaine de stockage. Par conséquent, l'activité du NSC peut compromettre le volume et la morphologie des cellules lors de la transfusion et expliquer l'élimination des érythrocytes observée dans les 24 heures suivant la transfusion.

En conclusion, les canaux cationiques non sélectifs jouent un rôle dans l'homéostasie des globules rouges matures. Ils contribuent ou peuvent constituer l'origine de la fuite de cations. Ils sont à l'origine de maladies en cas de dysfonctionnement et la compréhension de leur fonctionnement dans ces conditions peut fournir des stratégies thérapeutiques. Enfin, ils sont clairement impliqués dans les lésions de stockage compromettant par leur activité l'efficacité transfusionnelle.

Abstract

Title: Characterization of cationic conductances of human erythrocytes and their involvement in health and disease

Erythrocytes possess many transport pathways at the plasma membrane. On one hand, anion permeability is very high and chloride can move freely. As a consequence, chloride is at equilibrium. On the other hand, cation permeability is very low, although it is not zero, a leak pathway exists, which is coupled to the operation of the Na+/K+ pump to ensure cation balance and homeostasis. However, red cell membranes are endowed with several ion channels. Normally silent, they will rapidly dissipate ionic gradients once activated. Albeit, the Gárdos channel, a Ca2+ -activated potassium channel and more recently Piezo1 a mechanosensitive cation channel permeable to Na+, K+, Ca2+ and Mg2+, have been extensively described, the exact nature of the cation leak is not yet fully elucidated. Many observations in healthy mature RBCs and in pathophysiological conditions lead to the conclusion that such cation leak proceed through a non-selective cation channel (NSC).

The functional characterization of cation channels is rendered difficult in RBCs by the prevalence of a massive chloride conductance hindering the observation of cationic conductances. Although patch‑clamp remains the golden standard for ion channel activity analysis, patch-clamping RBCs is challenging, laborious and imposes some constraints such as sustained pressure on the membrane. On the contrary, membrane potential estimation aided by proton ionophore CCCP allows the recording of membrane potential changes in RBC populations in real time and, thus, enables observation of ion channel activity as their opening alters the membrane potential.

Herein I present a pharmacological means (NS3623) for the enhancement of NSC channels in hyperpolarizing conditions with concomitant chloride conductance inhibition in freshly drawn healthy mature RBCs. This tool facilitates the study of NSC channels whose activities are small in comparison with the strong chloride conductance.

The properties of such compound was subsequently used to describe dysfunctional cation homeostasis in hereditary anemia using patient cells affected by different mutations on Gárdos or Piezo1 channels. As the technique is fast, reliable and inexpensive it provides an alternative diagnostic tool with the added advantage of producing ion channel activity information as it may be different even in patients with the same mutation and thus explain the severity.

The last part of the thesis deals with the alteration of cation balance upon storage conditions for transfusion purposes which is part of the so-called «storage lesion». To address this issue, ion channel activity was characterized throughout 42-day storage period of RBCs stored at 4° C in CPD-SAGM according to French regulations. Experimental approaches were devised upon the knowledge gained from NSC channel studies in both fresh RBCs from healthy donors and from hereditary anemia patients. NSC activity was shown to increase over time during storage and dramatic ion channel activity was observed during the last week. Consequently, NSC activity may jeopardize cell volume and morphology upon reinfusion and account for erythrocyte removal observed within 24 hours of transfusion.

In conclusion, Non-Selective Cation channels play an important role in mature RBCs. They contribute or may constitute the origin of cation leak. They cause disease when malfunctioning and insight into their operation in these conditions may supply with therapeutic strategies. They are involved in the storage lesion, and may account for the RBCs demise once back in the circulation.