Ecophysiologie Thèmes de Recherche

Thème 1 : Structure, fonction et évolution des pigments respiratoires

Responsable : F. Zal

a - Hémoglobines extracellulaires et polymorphisme

F. Zal, X. Bailly, D. Le Guen

Les hémoglobines extracellulaires d’annélides en double couche hexagonale sont des structures complexes qu’il était jusqu’alors impossible d’étudier sur des échantillons provenant d’individus uniques. L’émergence de nouvelles méthodes d’analyse rend désormais possible d’étudier le polymorphisme de ces structures complexes et de le mettre en relation avec la répartition spatio-temporelle de ces organismes au sein de leur environnement.
Nous avons en effet pu mettre en évidence un polymorphisme de structure entre les hémoglobines provenant d’individus de Arenicola marina prélevés à Saint-Pol de Léon et celles de l’aber de Roscoff, ainsi qu’entre celles d’individus de Riftia pachyptila provenant des sites ateliers 13°N et 9°50 sur la dorsale du Pacifique oriental. Ces observations sporadiques demandent dans un premier temps à être confirmées : s’agit-il d’un polymorphisme reflétant l’existence de populations différentes ? ou s’agit-il d’une plasticité phénotypique de ces pigments respiratoires ?
Au cours des prochaines campagnes océanographiques, nous collecterons des Riftia le long d’un gradient qui reste à définir sur nos deux zones d’étude. La même étude sera réalisée sur l’arénicole à Roscoff. Pour cette espèce, nous savons qu’il y a une répartition spatio-temporelle des individus le long de la zone intertidale, les jeunes colonisant le haut de l’estran et les individus âgés, le bas de l’estran. Ainsi, ces animaux ne subissent pas les mêmes conditions environnementales notamment en ce qui concerne les pressions partielles d’oxygène. Il serait donc intéressant d’étudier conjointement, la structure et la fonction de leurs hémoglobines afin de savoir si ces paramètres varient au cours de leur stade de vie, ou si ces organismes possèdent un panel de chaînes de globine qu’ils peuvent associer de façon différentielle en fonction du milieu qu’ils rencontrent, expliquant ainsi leur large répartition sur l’estran.

Collaborations
Ce projet sera réalisé en collaboration avec l’équipe Chimie Marine de la Station Biologique de Roscoff qui effectuera les mesures chimiques dans l’habitat de chaque individu au moment de l’échantillonnage et les chimistes du Département Environnement Profond de l’IFREMER.

b – Evolution moléculaire des hémoglobines extracellulaires d’annélides

F. Zal, X. Bailly, C. Chabasse, S. Hourdez

Les données biochimiques et d’évolution moléculaire obtenues sur les hémoglobines extracellulaires d’annélides (EHb HBL) par notre équipe nous ont permis d'esquisser l'histoire évolutive de ces groupes à partir des structures quaternaires et primaires de leurs Hbs, des séquences nucléotidiques des chaînes de globine composant ces molécules ainsi que de leurs capacités, ou de leurs incapacités à fixer l'H₂S. Notre hypothèse est que les Ehb HBL sont apparues par duplication de gènes de globines chez l’ancêtre commun des annélides avant l’explosion cambrienne, dans un environnement caractérisé par une abondance d’H₂S beaucoup plus marquée qu’à notre époque. Ainsi, l'EHb HBL originelle aurait eu deux fonctions principales chez cet organisme primitif, le transport de l'oxygène et la détoxication de l'H2S. Cette dernière fonction, associée à la présence de cystéines libres, subsisterait actuellement sur les EHbs appartenant à des espèces d'annélides colonisant des milieux riches en H2S. Selon ce scénario évolutif, chez les Vestimentifères, le mécanisme de détoxication initialement présent aurait évolué en mécanisme de transport, parallèlement à l'apparition de la symbiose avec des bactéries chimioautotrophes.
Afin de tester ces hypothèses, nos travaux seront poursuivis par le séquençage de plusieurs cDNA de globines composant des EHbs HBL appartenant à diverses annélides colonisant des niches écologiques différentes. Les espèces seront choisies afin de couvrir au maximum l’ensemble de ce taxon. Les résultats ainsi obtenus seront interprétés à la fois d’un point de vue fonctionnel mais également d’un point de vue évolutif.

Collaborations
Ce projet sera réalisé en collaboration avec l’équipe Evolution et Génétique des Populations Marines de la Station Biologique de Roscoff (D. Jollivet).

c - Rôle(s) de la plasticité phénotypique des hémocyanines de crustacés

F. Zal, F. Lallier, D. Le Guen

Les hémocyanines (Hcs) sont les pigments respiratoires de la plupart des arthropodes. Ces Hcs sont constituées de chaînes polypeptidiques d'environ 75 KDa. Chacune des sous-unités possède un site actif, contenant une paire d’atomes de cuivre qui fixe la molécule d’O2. Les sous-unités s’associent par six pour former des hexamères ou oligohexamères d'environ 100 Å de diamètre.
Un des traits caractéristiques les plus intéressants des Hcs est l’hétérogénéité très marquée des sous-unités. Des expériences de réassociation avec des sous-unités isolées et leurs combinaisons montrent que chacune de ces sous-unités joue un rôle spécifique sur l’architecture et la fonction de ses assemblages. Ainsi, l'hétérogénéité des sous-unités a deux impacts majeurs sur la fonction des Hcs : i) la formation de structures plus importantes que les hexamères, créant de nouveaux niveaux d’interactions allostériques ; ii) une augmentation de la plasticité fonctionnelle en partie due à l’effet de différents cofacteurs. La composition en sous-unités des différentes formes d’Hcs peut varier en fonction de nombreux facteurs intrinsèques (e.g. stade de développement, adaptation à long ou moyen terme) ou extrinsèques (e.g. conditions physico-chimiques du milieu, adaptation à court terme).
Le présent projet se focalisera sur l'adaptation à court terme de plusieurs types de crustacés. Nous avons choisi comme espèce référence le crabe littoral Carcinus maenas. Une étude analogue sera réalisée sur des crabes hydrothermaux, provenant des sites Atlantique (Segonzasia mesatlantica) ou Pacifique (Bythograea thermydron), en fonction de leur disponibilité et de la programmation des campagnes océanographiques sur ces sites. Ces modèles biologiques seront soumis à des stress environnementaux divers (e.g. hypoxie, hypercapnie, changement de salinité, de température...) suivis de l'analyse structurale de leur Hcs par différentes techniques de biochimie (chromatographie basse pression), de chimie (spectrométrie de masse) et de biophysique (cryo-microscopie).
Une étude fonctionnelle des différents états de polymérisation sera également effectuée permettant de déterminer les avantages physiologiques des complexes ainsi formés. Toutes ces expériences seront réalisées dans des microcosmes à pression atmosphérique ou sous pression pour les espèces hydrothermales. L'environnement chimique sera régulé par un système développé et mis au point à la station biologique de Roscoff, le système SYRENE.

Collaborations
Ce projet sera réalisé en collaboration avec l’équipe du Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-Organique de Strasbourg (UMR 7509).

d – Volet valorisation : hémoglobines extracellulaires et substitut sanguin

F. Zal, X. Bailly, C. Chabasse, M. Rousselot, S. Hourdez, F. Lallier

Nos recherches sur les hémoglobines extracellulaires d’annélides ainsi que la rencontre d’hématologues au cours de divers rassemblements scientifiques nous ont permis d’identifier une molécule intéressante possédant toutes les caractéristiques définies par le domaine médical pour être un substitut sanguin potentiel. En effet, il nous est très vite apparu, que certaines hémoglobines extracellulaires d'annélides répondaient au cahier des charges d'un substitut sanguin ou d'un composé pour la perfusion d'organes : i) c'est une hémoglobine qui est naturellement polymérisée ; ii) elle est extracellulaire et de haut poids moléculaire ; iii) elle est extrêmement stable, très résistante à l'auto-oxydation et à la dilution même pour des solutions très diluées ; iv) ses propriétés fonctionnelles d'oxygénation et de coopérativité sont similaires à celles de l'HbA humaine au pH physiologique et enfin v) c'est une molécule naturelle, extrêmement abondante et relativement facile à purifier, et caractérisée par des propriétés d'auto-assemblage remarquables.
Bien évidemment, ce travail réalisé actuellement par deux doctorants (soutenance prévue en 2005) ne nous fait pas dévier de nos objectifs initiaux. Cette recherche s’effectue en parallèle et de façon tout à fait intégrée, notamment dans l’utilisation des résultats qui seront utilisés, après protection, dans un contexte plus global d’écophysiologie moléculaire. Actuellement, un brevet protége ces résultats et d’autres dépôts de brevet sont en cours.

Thème 2 : Adaptation et évolution en milieu réduit

Responsable : F. Lallier

a - Etude des mécanismes de défenses antioxydants chez les annélides

F. Zal, A. Andersen

Ce projet vise à analyser les interactions, tant positives que néfastes, du sulfure d’hydrogène (H2S) sur les systèmes antioxydants chez des annélides marines colonisant des milieux riches en H2S et soumis naturellement à des menaces oxydatives : Paralvinella grasslei et Alvinella pompejana des sources hydrothermales profondes et Arenicola marina des zones intertidales envasées. La forte activité métabolique aérobie associée aux températures de vie des alvinellidés génère des taux très importants de ROS (Reactive Oxygen Species), dont la toxicité est encore accrue par les fortes teneurs en métaux dissous. L’arénicole, bien que vivant dans un environnement très différent, est elle aussi exposée à des ROS générés photochimiquement dans les eaux de surface. L’H2S de ces milieux, combiné avec l’oxygène, augmente encore la production de ROS ; de plus, les sulfures sont connus pour être des inhibiteurs d’enzymes héminiques comme l’enzyme anti-oxydante catalase. Il est donc intéressant de déterminer les défenses enzymatiques anti-oxydantes qui protègent ces animaux contre les dommages oxydatifs. D’ores et déjà un premier bilan des enzymes anti-oxydantes et d’enzymes métaboliques présentes chez P grasslei et A. pompejana a été réalisé. Il s’agit maintenant d’aller plus loin dans l’étude de ces mécanismes en utilisant des mésocosmes pressurisés dans lesquels les conditions physico-chimiques seront contrôlées.
La biochimie des systèmes enzymatiques antioxydants qui seront au centre de cette étude est basée sur des transferts d’électrons entre divers intermédiaires au niveau de groupements thiols/disulfure. Ces systèmes enzymatiques sont par ailleurs très bien conservés au cours de l’évolution, mais ne sont encore abordés que dans quelques études préliminaires chez les invertébrés marins. Nous étudierons de manière approfondie les enzymes de types peroxyrédoxines (thiorédoxine peroxydases) et leurs protéines associées (thiorédoxines, thiorédoxine réductases) ainsi que les glutathions peroxydases et réductases chez les invertébrés modèles.
Cette étude devrait nous permettre de mettre à jour de nouveaux rôles physiologiques de l’H₂S dans les cellules animales. Cette approche intégrant plusieurs modèles devrait nous renseigner sur l’évolution des systèmes antioxydants chez des organismes vivant dans des conditions fortement réductrices.

Collaborations
Ce projet sera réalisé en collaboration avec une équipe belge de l’Université Catholique de Louvain-La-Neuve. Il est soutenu par l’action TOURNESOL mis en place par le Ministère des Affaires Etrangères.

b – Adaptation et évolution d’une symbiose thiotrophe: approche transcriptomique et protéomique

F. Lallier, S. Sanchez, S. Hourdez, F. Zal, A. Andersen, D. Le Guen

Riftia pachyptila est une symbiose stricte, sans mode alternatif de nutrition, mais néanmoins extrêmement efficace, comme en témoigne leur vitesse de croissance exceptionnelle. Les bactéries sont intracellulaires, contenues dans les vacuoles des bactériocytes, ces cellules formant l'essentiel d'un organe interne, le trophosome. Ce sont des g-protéobactéries, autotrophes, sulfo-oxydantes strictes, nécessitant du CO₂ comme source de carbone, et de l'O₂ et de l'H₂S comme source d'énergie chimique. Ces besoins métaboliques et la position interne des bactéries dans l'animal imposent l'existence d'adaptations spécifiques chez l’hôte, permettant d’acquérir dans le milieu, puis de transporter jusqu'aux bactéries les métabolites nécessaires.

En fait, on peut considérer Riftia comme un modèle de symbiose en cours d'internalisation. Les bactéries sont vacuolisées au sein du cytoplasme des bactériocytes mais la transmission est encore horizontale, ce qui implique que les bactéries existent sous forme libre dans le milieu hydrothermal profond, bien que personne ne soit encore arrivé à les cultiver une fois isolées de leur hôte. Cette perte de la capacité des symbiotes à vivre libre suggère une forte interaction entre les génomes hôte/symbiote. Dans ce contexte, il semble particulièrement intéressant d'identifier et de caractériser les protéines les plus impliquées dans les adaptations au mode de vie symbiotique, afin de disposer par la suite de "cibles" pertinentes dans les études de physiologie.
Notre objectif est d’identifier les protéines de l’hôte (protéines de structure, enzymes, transporteurs, etc) spécifiquement impliquées dans le fonctionnement de cette symbiose, en comparant différents tissus de Riftia : l’un directement impliqué dans la relation symbiotique avec les bactéries (trophosome), l’autre dans l’acquisition des molécules inorganiques à partir du milieu environnant (panache branchial), avec un troisième tissu de « référence » qui ne soit pas directement impliqué dans la symbiose (muscles de la paroi du corps). Pour atteindre cet objectif, nous comptons développer en parallèle une double approche :

sur le transcriptome, à partir de banques d’ADNc issues des 3 tissus, et en utilisant l’hybridation soustractive suppressive (SSH) ;

sur le protéome, à partir d’extraction de protéines membranaires et cytoplasmiques des 3 tissus, et en utilisant une séparation par gels d’électrophorèse bidimensionnels (2DGE) couplée à une caractérisation des spots d’intéret par spectrométrie de masse (MS)

La réalisation de ce projet scientifique est placée sous de très bons auspices d'un point de vue financier (PRIR Région Bretagne) et d’un point de vue technique, puisqu'il met � profit les plateaux techniques r�alis�s dans le cadre de GENOMER et OUEST GENOPOLE : séquenceur capillaire haut débit, plate-forme de gel 2D, spectromètres de masse équipés pour la protéomique. Ce projet s'inscrit �galement dans les th�matiques du REX "Marine Genomics Europe" et du GIS "Génomique Marine", tous deux coordonné par la Station Biologique de Roscoff.

c – Adaptations respiratoires et évolution des Polynoidae

S. Hourdez, A. Andersen, F. Lallier

L’objectif de ce projet est d’étudier les adaptations respiratoires d’annélides vivant en milieu hypoxique (écosystèmes chimiosynthétiques abyssaux et intertidaux), dans une perspective évolutive. Notre approche consistera à étudier les phylogénies d'espèces issues d'analyses moléculaires et cladistiques sur des caractères neutres et à les comparer à celles qui sont obtenues à partir de certains caractères morphologiques, anatomiques, ou biochimiques suspectés d’être sous sélection par l'habitat. Des corrélations seront recherchées entre les divergences génétiques observées et le développement de certaines adaptations. Ceci sera réalisé afin de mesurer l'effet de l'environnement sur les mécanismes de spéciation qui ont conduit à la diversification de la famille des Polynoidae.
La physiologie comparée s’est traditionnellement consacrée à rechercher quelles sont, pour une espèce a priori adaptée à son environnement, les modifications fonctionnelles qui confèrent à l'organisme un avantage sélectif par rapport à d’autres espèces. Mais de plus en plus, le lien avec l’histoire évolutive de ces adaptations revêt une importance croissante dans cette discipline. Une approche comparée, s’intéressant à un ensemble de caractères adaptatifs dans un groupe d’espèces dont la phylogénie est connue, peut parfaitement répondre à ce type de problématique à condition de pouvoir séparer les effets de l’hérédité de ceux d’une évolution sélectionnée. C’est ce que permet aujourd’hui l’analyse des contrastes indépendants. Pour qu’une telle analyse soit envisageable, il faut restreindre le champ d’investigation à une fonction donnée. La nature de cette fonction doit être la convergence de plusieurs caractères à la fois morphologiques et moléculaires responsables du trait physiologique considéré, et ce dans un groupe taxonomique suffisamment limité présentant néanmoins des variations marquées.
Dans le contexte de spéciation par l’habitat considéré ici, et en partant de l’environnement des sources hydrothermales, des suintements froids et littoraux, l’évolution de la fonction respiratoire au sein de la famille des Polynoidae apparaît comme un modèle approprié à une approche de physiologie comparée sous contrainte phylogénétique. La famille des Polynoidae semble donc une très bonne candidate pour l’étude de l’évolution des espèces et de leurs adaptations respiratoires au milieu hydrothermal. Elle possède de nombreux représentants provenant de milieux très variés, et des caractéristiques morphologiques et biochimiques contrastées. Ainsi au travers ce projet, nous chercherons à répondre aux questions suivantes : les caractères adaptatifs observés sont-ils ou non corrélés à la pression de l’environnement ? est-ce que les différentes structures d’hémoglobines de Polynoidae sont des innovations moléculaires ou sont-ils dûes à des processus aléatoires au cours de l’évolution de cette famille y a t il ou non une forte pression de sélection négative sur les enzymes du métabolisme anaérobie ? ...

Collaborations
Ce projet sera réalisé en collaboration avec plusieurs équipes : l’équipe Evolution et Génétique des Populations Marines de la Station Biologique de Roscoff et l’équipe de C.R. Fisher (Penn State University). En ce qui concerne la taxonomie et la phylogénie moléculaire des Polynoidae, nous nous appuierons sur les connaissances en systématique de Daniel Desbruyères (Ifremer, Brest), et sur le Service Commun de Bio-Systématique de Jussieu.

SBR